Extinktionskoeffizient-Rechner

Der Koeffizient ist keine Eigenschaft des Moleküls für sich genommen. Er ist eine Eigenschaft des Moleküls bei einer Wellenlänge, und deshalb führt jeder anderswo angegebene Koeffizient seine Wellenlänge mit sich, und deshalb kann ein Wert bei 280 Nanometern nicht dazu dienen, eine bei 214 Nanometern genommene Ablesung zu interpretieren. Die Rechnung selbst ist eine gewichtete Zählung: jedes Tryptophan addiert 5500, jedes Tyrosin 1490 und jedes Disulfid-gebundene Cysteinpaar 125, alles in inversen molaren Zentimetern. Phenylalanin addiert hier nichts, weil sein Ring tiefer im Ultraviolett absorbiert als die Standardwellenlänge.

Das Lehrreichste an dieser Liste ist, wie wenig von der Sequenz sie benutzt. Zwei Peptide gleicher Länge mit derselben Anzahl an Tryptophanen und derselben Anzahl an Cystinpaaren liefern denselben Koeffizienten, gleichgültig wie verschieden alle übrigen Reste sind. Eine Kette saurer Reste und eine Kette basischer Reste sehen für dieses Modell gleich aus. Das macht die Zahl für eine Konzentrationsbestimmung brauchbar und für die Beschreibung eines Moleküls untauglich, und es lohnt sich zu wissen, welche der beiden Sie in der Hand halten, bevor Sie sie benutzen.

Der Disulfidterm ist die einzige Eingabe, die sich nicht aus einer Sequenz ablesen lässt. Ein Cystein kann frei sein, mit einem zweiten Cystein gepaart sein oder an etwas völlig anderes gebunden, und nur die gepaarte Form trägt bei. Eine Ein-Buchstaben-Sequenz kann diese Fälle nicht unterscheiden, die Anzahl wird also von Hand eingegeben statt erschlossen, und deshalb gibt es dieses Feld auf diesem Formular überhaupt. Gibt man die Anzahl der Cysteine ein, nimmt man an, dass jedes davon einen Partner gefunden hat, und eine ungerade Anzahl macht das unmöglich. Die Aromatizitätsseite zählt die Reste, die den Rest der Summe bestimmen.

Diese Koeffizienten wurden an vollständig reduziertem und vollständig denaturiertem Material gemessen, und das Modell gilt so weit, wie eine Messung diese Bedingungen reproduziert. Denaturieren legt aromatische Seitenketten frei, die sonst in einer gefalteten Struktur lägen, und Reduzieren bricht Disulfide, sodass jeder Cystinterm genau einmal erfasst wird. Eine noch gefaltete Probe absorbiert weniger, als das Modell vorhersagt, die daraus abgelesene Konzentration fällt also zu niedrig aus. Das ist eine systematische Verzerrung mit bekannter Richtung und kein zufälliges Streuen, und die Richtung im Voraus zu kennen macht sie korrigierbar: denaturieren Sie die Probe, oder lesen Sie das Ergebnis als untere Schranke statt als Konzentration.

Die zweite Annahme lautet, dass die aromatischen Seitenketten die einzige absorbierende Spezies in der Küvette sind. Alles andere, was bei 280 Nanometern absorbiert, wird dem Peptid angelastet, also hebt ein Puffer mit echter Extinktion, eine Spur Detergens oder eine Suspension feiner Partikel die Ablesung an und die daraus abgeleitete Konzentration ebenso. Das Gegenmittel ist ein Blindwert aus demselben Lösungsmittel ohne das Peptid. Aus genau diesem Grund wird ein großer Teil der Peptidarbeit unter sauren Bedingungen durchgeführt, weil ein niedriger pH die Extinktion vieler Pufferbestandteile unterdrückt, statt sie zu erhöhen, und der Leitfaden zum Beer-Lambert-Gesetz stellt dar, was die Messung sonst noch braucht.

Die dritte Annahme lautet, dass die Chromophore sich voneinander unabhängig verhalten. Das Modell gibt jedem aromatischen Ring einen festen Koeffizienten und korrigiert nichts dafür, dass zwei davon nebeneinanderliegen, dass ein Ring in einem hydrophoben Inneren vergraben ist oder dass sich eine Probe in der Küvette assoziiert hat. Für die Fälle, für die die Methode gebaut wurde, sind diese Korrekturen klein. Für ein Peptid, das aggregiert, sind sie überhaupt nicht klein, und Aggregation ist der Fehlerfall, den man von außen am schwersten bemerkt, weil das Spektrum weiterhin wie ein sauberes Absorptionsband mit plausibler Form aussieht.

Ein Peptid ohne Tryptophan und ohne Tyrosin reduziert die Summe auf den Disulfidterm allein. Ein reduziertes Peptid ohne Cystin hat daher einen Koeffizienten von genau null, und das Gesetz besagt dann, dass jede beliebige Konzentration eine Extinktion von null erzeugt. Das ist kein Zerbrechen der Arithmetik. Es ist die zutreffende Feststellung, dass die Messung keine Information darüber trägt, wie viel Peptid in der Küvette ist. Ein einziges Tyrosin genügt, um das vollständig zu ändern, und ebenso ein einziges gebundenes Cystinpaar, weshalb Peptide oft so konstruiert werden, dass sie eines tragen.

Wird das Gesetz nach der Konzentration aufgelöst, teilt man die gemessene Extinktion durch das Produkt aus Koeffizient und Weglänge, ein Koeffizient, der gegen null geht, erzeugt also eine sehr große und sehr selbstsichere Zahl, die vollständig aus Rauschen zusammengesetzt ist. Nichts an dem Ergebnis sieht auf der Seite falsch aus. Der Beer-Lambert-Konzentrationsrechner weist deshalb einen Koeffizienten von null oder negativ von vornherein zurück, und diese Zurückweisung ist die nützliche Antwort und kein Hindernis. Ein kleiner, aber von null verschiedener Koeffizient ist beinahe genauso schlecht, weil er denselben Fehler verstärkt statt ihn zu beseitigen, und die Verstärkung ist völlig stumm.

Für ein solches Peptid ist die Konzentration aus der Sequenz nicht bestimmbar. Keine Arithmetik auf den Buchstaben liefert sie, und jede konkrete Zahl für ein konkretes Peptid müsste aus einer Messung oder aus einer zitierten Quelle stammen, die genau dieses Molekül beschreibt, und beides kann diese Website nicht liefern. Stattdessen lässt sich die Gestalt des Problems sagen: Die Möglichkeiten sind eine Nachweismethode, die auf etwas anderes anspricht, oder eine Messung bei einer Wellenlänge, bei der ein Teil der Probe tatsächlich absorbiert. Das deutlich zu sagen ist nützlicher als eine plausible Zahl, denn ein falscher Koeffizient geht unmittelbar in eine Konzentration ein und von dort in jede Verdünnung, die aus dieser Konzentration berechnet wird.

Der molare Koeffizient ist nicht die einzige Form dieser Zahl. Teilen Sie ihn durch die mittlere Molmasse, erhalten Sie einen Massenextinktionskoeffizienten, üblicherweise in mL g^-1 cm^-1 geschrieben, und das ist die Form, die zu einer Konzentration in Gramm pro Liter passt statt zu einer in Mol pro Liter. Die Arithmetik ist einfach: Ein Koeffizient von 12615 für ein Peptid mit einer mittleren Molmasse von etwa 611 ergibt einen Massenkoeffizienten von etwa 20.7. Der Rechner für die mittlere Molekülmasse liefert die zweite dieser beiden Zahlen, und die Rückumrechnung ist dieselbe Division in die andere Richtung, die beiden Formen können also nie widersprechen, solange für beide dieselbe Molmasse verwendet wird.

Die beiden Formen zu vermischen ist der bleibende Fehler in diesem Thema, und er geht um die Molmasse daneben statt um einen kleinen Faktor, weshalb er so lange unbemerkt bleiben kann. Der Leitfaden zu Massenkonzentration und Molarität stellt den Zusammenhang zwischen den beiden Konzentrationseinheiten dar, der unter der Umrechnung liegt, und eine Massenkonzentration in den Beer-Lambert-Absorptionsrechner einzusetzen zeigt Ihnen die Größe des entstehenden Fehlers direkt an, statt ihn Ihnen zum Nachdenken zu überlassen. Die Ausgabe ist immer noch eine Extinktion, sie ist immer noch dimensionslos, und sie liegt schlicht um den Faktor mehrerer hundert daneben.