Beer-Lambert-Konzentrationsrechner

Die Auflösung nach der Konzentration stellt den Extinktionskoeffizienten in den Nenner, ein Fehler darin geht also eins zu eins und in die entgegengesetzte Richtung durch. Ein um zehn Prozent zu hoher Koeffizient ergibt eine um etwa neun Prozent zu niedrige Konzentration, denn das Teilen durch 1.1 statt durch 1.0 liefert 0.909 des gemeinten Werts. Nichts in der Arithmetik warnt Sie. Die Ausgabe ist eine glatte Zahl mit mehreren Nachkommastellen, und die Größe des Fehlers ist klein genug, um für einen Rundungsunterschied gehalten zu werden, wenn Sie nicht danach suchen.

Weil der additive Koeffizient den größten Teil einer Sequenz ignoriert, können zwei sehr verschiedene Peptide einen Koeffizienten teilen und damit auch einen systematischen Fehler. Das wirkt in beide Richtungen. Es bedeutet, dass ein Peptid, dessen berechneter Koeffizient zufällig nahe an der Wahrheit liegt, eine vertrauenswürdige Konzentration ergibt, obwohl fast nichts an ihm modelliert wurde, und es bedeutet, dass ein Peptid mit vergrabenen aromatischen Resten oder einer nicht gezählten Disulfidbrücke eine Konzentration ergibt, die einheitlich in einer Richtung danebenliegt, die Sie im Voraus durchdenken können, statt sich unvorhersagbar zu verteilen. Ein Rest Unterschied in der aromatischen Anzahl ist auf dieser Seite ein größerer Effekt als alles andere in der Rechnung, weshalb sich die Anzahl vor jeder Verwendung der Zahl prüfen lohnt.

Die Anordnung kann außerdem nicht erkennen, dass die falsche Spezies gemessen wird. Das Gesetz beschreibt die Transmission durch eine homogene Lösung, eine Ablesung an einer aggregierten Probe oder an einer, die etwas anderes enthält, das bei derselben Wellenlänge absorbiert, wird also in eine Zahl umgerechnet, die als Konzentration des Peptids etikettiert ist. Die Rechnung stimmt und das Etikett ist falsch, und deshalb ist eine Vorhersage aus dem Beer-Lambert-Absorptionsrechner eine wirklich nützliche Gegenprüfung und keine bloße Wiederholung. Nichts in der Umstellung kann eine Peptidkonzentration von einer Suspensionskonzentration unterscheiden, denn beide erzeugen eine Ablesung und beide haben irgendwo einen Koeffizienten hängen.

Der Fehler, der in der Praxis am meisten zählt, steckt in der Extinktion selbst, denn die Extinktion ist eine logarithmische Größe, die von einem Gerät mit ungefähr fester absoluter Genauigkeit abgelesen wird. Der relative Fehler der Konzentration ist gleich dem relativen Fehler der Extinktion, eine Ablesung von 0.055 bei einer absoluten Genauigkeit von 0.005 trägt also rund neun Prozent Unsicherheit, während eine Ablesung von 0.005 bei derselben Genauigkeit rund hundert Prozent trägt. Dasselbe Gerät, derselbe Koeffizient, dieselbe Weglänge und eine völlig andere Qualität der Antwort. Der Koeffizient addiert seinen eigenen relativen Fehler obendrauf: Ist er um zehn Prozent unsicher und die Ablesung um zehn Prozent und sind die beiden unabhängig, liegt die Konzentration eher um zwanzig als um zehn Prozent daneben.

Der Grund lohnt sich zu verstehen, weil er ändert, was Sie dagegen tun. Das Gerät ist bei niedrigen Ablesungen nicht um neun Prozent schlechter, es ist absolut betrachtet in der Extinktion gleich genau, und eine kleine Zahl durch diese absolute Unsicherheit zu teilen erzeugt eine große relative. Die Messung also sorgfältiger zu wiederholen ist nicht das Gegenmittel. Es ist, die Extinktion auf eine von drei Arten zu erhöhen: ein längerer Weg, eine höhere Konzentration oder eine andere Wellenlänge, bei der die Probe stärker absorbiert. Die ersten beiden sind kostenlos, denn beides sind Entscheidungen, die fallen, bevor die Probe das Gerät erreicht, und keine Korrekturen danach.

Eine Extinktion unter etwa 0.1 abzulesen lohnt sich auf einem Tischgerät also selten, was die Arithmetik auch produziert. Die nützliche Gewohnheit ist, die Ablesung vorherzusagen und einen Bereich zwischen 0.2 und 1.0 anzusteuern, wo der relative Fehler am kleinsten ist und der Detektor noch genug Signal hat, um zu arbeiten. Der Leitfaden zum Runden und zu kleinen Volumen behandelt, wie eine kleine gemessene Größe aufzuschreiben ist, wenn man sie hat. Vorherzusagen, bevor man misst, ist der einzige Punkt im ganzen Verfahren, an dem der Preis einer schlechten Wahl noch nicht gezahlt ist, und er kostet Sekunden.

Ein Gerät meldet eine Differenz zwischen zwei Lichtniveaus, und was als null zählt, hängt vollständig davon ab, worauf die Ablesung bezogen wurde. Ein Blindwert aus demselben Lösungsmittel und demselben Puffer, aber ohne Peptid, misst die Extinktion, die alles andere in der Küvette beiträgt. Ziehen Sie diesen ab, und der Rest gehört dem Peptid. Ziehen Sie ihn nicht ab, wird der gesamte Hintergrund der Probe angelastet, und deshalb kommt eine Konzentration, die aus einer nicht genullten Ablesung in einem absorbierenden Puffer abgeleitet wurde, um einen großen und völlig systematischen Betrag zu hoch heraus. Der Leitfaden zum Beer-Lambert-Gesetz behandelt, wie das üblicherweise geregelt wird.

Das ist der tiefere Grund, warum UV-Arbeit an Peptiden so oft in verdünnter Säure und nicht in einem konventionellen Puffer durchgeführt wird. Ein niedriger pH hält viele übliche Pufferbestandteile davon ab, überhaupt erst bei 280 Nanometern zu absorbieren, der Blindwert ist also klein und leicht richtig zu bekommen statt groß und hoffnungsvoll abgezogen. Er senkt außerdem die Wahrscheinlichkeit, dass das Peptid selbst im Puffer seinen Zustand wechselt, was den Koeffizienten ebenso entwerten würde wie den Blindwert. Keine der beiden Entscheidungen ist kostenlos, und beide fallen der Messqualität wegen und nicht der Probe wegen.

Zwei Prüfungen lohnen sich, bevor eine abgeleitete Konzentration irgendwo verwendet wird. Bestätigen Sie zuerst, dass die Extinktion in einem Bereich liegt, in dem die Ablesung etwas bedeutet, praktisch also über etwa 0.1 und unter etwa 1.0. Rechnen Sie zweitens das Ergebnis mit der Peptidmolmasse aus dem Rechner für die mittlere Molekülmasse in eine Massenkonzentration um und sehen Sie, ob eine Zahl herauskommt, die Sie wiedererkennen. Eine große Lücke zwischen den beiden ist fast immer ein Einheitenfehler und kein Chemieproblem, und der Zusammenhang zwischen den beiden Konzentrationseinheiten steht im Leitfaden zu Massenkonzentration und Molarität . Stammt der Koeffizient aus dem Extinktionskoeffizient-Rechner , prüfen Sie ihn dabei gleich gegen die Anzahl der aromatischen Reste.

Eine dritte Prüfung ist zu verdünnen. Eine Probe und eine bekannte Verdünnung davon abzulesen sollte zwei Konzentrationen im Verhältnis des Verdünnungsfaktors ergeben, und der Rechner für serielle Verdünnungen legt dar, wie man das sauber aufsetzt. Liegen die beiden Ergebnisse nicht in diesem Verhältnis, ist der Zusammenhang über den gerade abgedeckten Bereich nicht linear, was direkt auf Aggregation oder Streulicht zeigt und nicht auf die Arithmetik. Und war der beteiligte Koeffizient von Anfang an sehr klein, rettet keine dieser Prüfungen das Ergebnis, denn eine Messung durch etwas nahe null zu teilen ist überhaupt keine Messung.