Calcolatore della concentrazione di Beer-Lambert

Risolvere rispetto alla concentrazione mette il coefficiente di estinzione al denominatore, quindi un errore in esso passa uno per uno e nella direzione opposta. Un coefficiente troppo alto del dieci per cento dà una concentrazione troppo bassa di circa il nove per cento, perché dividere per 1.1 invece che per 1.0 restituisce 0.909 del valore voluto. Nell’aritmetica non c’è nulla che ti avverta. L’uscita è un numero pulito con diverse cifre decimali, e la dimensione dell’errore è abbastanza piccola da poter essere scambiata per una differenza di arrotondamento se non la cerchi.

Poiché il coefficiente additivo ignora la maggior parte di una sequenza, due peptidi abbastanza diversi possono condividere un coefficiente e quindi condividere anche un errore sistematico. Questo taglia in entrambe le direzioni. Significa che un peptide il cui coefficiente calcolato capita per essere vicino alla verità dà una concentrazione fidabile anche se del peptide non è stato modellato quasi nulla, e significa che un peptide con aromatici sepolti o con un disolfuro non contato dà una concentrazione sistematicamente sbagliata in una direzione che puoi ragionare in anticipo invece che spargersi in modo imprevedibile. Una differenza di un residuo nel conteggio aromatico ha su questa pagina un effetto maggiore di qualunque altra cosa nel calcolo, il che rende il conteggio degno di verifica prima che il numero venga usato per qualcosa.

La sistemazione non può inoltre rilevare che si sta misurando la specie sbagliata. La legge descrive la trasmissione attraverso una soluzione omogenea, quindi una lettura da un campione aggregato, o da uno che contiene qualcos’altro che assorbe alla stessa lunghezza d’onda, viene convertita in un numero etichettato come concentrazione del peptide. L’aritmetica è giusta e l’etichetta è sbagliata, ed è per questo che una previsione del calcolatore dell’assorbanza con la legge di Beer-Lambert è un controllo incrociato genuinamente utile e non una ripetizione. Niente nel riordino può distinguere una concentrazione di peptide da una concentrazione di sospensione, perché entrambe producono una lettura e entrambe hanno un coefficiente attaccato da qualche parte.

L’errore che conta di più nella pratica sta nell’assorbanza stessa, perché l’assorbanza è una grandezza logaritmica letta da uno strumento con un’accuratezza assoluta all’incirca fissa. L’errore relativo sulla concentrazione è uguale all’errore relativo sull’assorbanza, quindi una lettura di 0.055 con un’accuratezza assoluta di 0.005 porta circa il nove per cento di incertezza, mentre una lettura di 0.005 con la stessa accuratezza porta circa il cento per cento. Stesso strumento, stesso coefficiente, stessa lunghezza del percorso ottico, e una qualità di risposta completamente diversa. Il coefficiente aggiunge il suo proprio errore relativo sopra, quindi se il coefficiente è incerto del dieci per cento e la lettura è incerta del dieci per cento e le due sono indipendenti, la concentrazione è più vicina al venti per cento di scarto che al dieci.

Il motivo vale la pena capirlo perché cambia che cosa se ne fa. Lo strumento non è nove per cento peggiore alle letture basse; è ugualmente preciso in termini di assorbanza assoluta, e dividere un numero piccolo per quell’incertezza assoluta ne produce una grande relativa. Quindi ripetere la misura con più cura non è il rimedio. Lo è alzare l’assorbanza, e in uno di tre modi: un percorso più lungo, una concentrazione più alta, oppure una lunghezza d’onda diversa alla quale il campione assorbe più fortemente. I primi due sono gratuiti, perché sono entrambi decisioni prese prima che il campione arrivi allo strumento e non correzioni applicate dopo.

Leggere un’assorbanza sotto circa 0.1 su uno strumento da banco vale quindi raramente la pena, qualunque cosa produca l’aritmetica. L’abitudine utile è prevedere prima la lettura e mirare a qualcosa fra 0.2 e 1.0, dove l’errore relativo è più piccolo e il rivelatore ha ancora abbastanza segnale per lavorare. La guida all’arrotondamento e ai piccoli volumi copre come si deve scrivere una grandezza misurata piccola una volta che la si ha. Prevedere prima di misurare è l’unico punto dell’intera procedura in cui il costo di una cattiva scelta non è ancora stato pagato, e richiede secondi.

Uno strumento riporta una differenza fra due livelli di luce, e che cosa conta come zero dipende interamente da che cosa sia stato preso a riferimento la lettura. Un bianco preparato con lo stesso solvente e lo stesso tampone ma senza peptide misura l’assorbanza contribuita da tutto il resto nella cuvetta. Sottrai quella e il resto appartiene al peptide. Non sottrarla significa addebitare l’intero fondo al campione, ed è per questo che una concentrazione ricavata da una lettura non sottratta il bianco in un tampone assorbente esce alta di un margine grande e del tutto sistematico. Il lavoro su Beer-Lambert copre come questa cosa viene normalmente organizzata.

Questa è la ragione di fondo per cui il lavoro UV sui peptidi viene così spesso fatto in acido diluito anziché in un tampone convenzionale. Un pH basso impedisce a molti componenti di tampone comuni di assorbire a 280 nanometri fin dall’inizio, quindi il bianco è piccolo e facile da sbagliare il meno, anziché grande e sottratto con speranza. Riduce anche la probabilità che il peptide stesso cambi stato nel tampone, il che invaliderebbe sia il coefficiente sia il bianco. Nessuna delle due scelte è gratuita, ed entrambe sono fatte per la qualità della misura e non per il bene del campione.

Vale la pena eseguire due controlli prima che una concentrazione ricavata venga usata da qualche parte. Primo, confermare che l’assorbanza si trovi in un intervallo in cui la lettura significa qualcosa, che in pratica significa sopra circa 0.1 e sotto circa 1.0. Secondo, convertire il risultato in una concentrazione di massa usando la massa molare del peptide dal calcolatore del peso molecolare medio e vedere se assomiglia a un numero che si riconosce. Un grande scarto fra i due è quasi sempre un errore di unità e non un problema di chimica, e la relazione fra le due unità di concentrazione è esposta nella guida alla concentrazione di massa rispetto alla molarità . Se il coefficiente è venuto dal calcolatore del coefficiente di estinzione , controllalo contro il numero di residui aromatici mentre ci sei.

Un terzo controllo è diluire. Leggere un campione e poi una diluizione nota di esso dovrebbe dare due concentrazioni nel rapporto del fattore di diluizione, e il calcolatore delle diluizioni seriali espone come impostarlo in modo pulito. Quando i due risultati non sono in quel rapporto, la relazione non è lineare sull’intervallo che hai appena coperto, il che punta dritto all’aggregazione o alla luce dispersa e non all’aritmetica. E se il coefficiente coinvolto era comunque molto piccolo, nessuno di questi controlli salva il risultato, perché dividere una misura per qualcosa vicino a zero non è una misura.