La legge di Beer-Lambert lega l assorbanza alla concentrazione di un peptide con A = e x c x l, dove e e il coefficiente di estinzione molare, c la concentrazione molare e l il cammino ottico della cuvetta. Misurata a 280 nanometri, l assorbanza UV permette cosi di calcolare direttamente la concentrazione di una soluzione.
La relazione fisica
La legge di Beer-Lambert correla l assorbanza ottica con la concentrazione molare, il cammino ottico e il coefficiente di estinzione caratteristico della molecola:
A = e x c x ldove A e l assorbanza (adimensionale), e (epsilon) e il coefficiente di estinzione molare in M^-1 cm^-1, c e la concentrazione molare in mol/L, e l e il cammino ottico in centimetri (generalmente 1 cm in cuvetta standard).
Il calcolatore di assorbanza Beer-Lambert calcola A direttamente conoscendo e, c e l.
Come si calcola la concentrazione di un peptide con la legge di Beer-Lambert?
Nel lavoro pratico, l assorbanza e il dato misurato e la concentrazione e l incognita da determinare:
c = A / (e x l)Il calcolatore di concentrazione Beer-Lambert effettua questa divisione fornendo la concentrazione molare corrispondente.
Ricavare il cammino ottico
l = A / (e x c)Il calcolatore di cammino ottico Beer-Lambert risolve questa terza inversione algebrica.
Origine del coefficiente di estinzione molare
A 280 nm, l assorbimento ottico e dovuto quasi esclusivamente a residui aromatici e ponti disolfuro: triptofano, tirosina e cistina. I coefficienti individuali stabiliti in letteratura sono:
Trp: 5500 M^-1 cm^-1
Tyr: 1490 M^-1 cm^-1
cistina: 125 M^-1 cm^-1Questi valori derivano dagli studi di Gill e von Hippel (1989) e Pace et al. (1995). Il coefficiente complessivo della sequenza e la somma pesata:
e = (conteggio Trp x 5500) + (conteggio Tyr x 1490) + (coppie di cistina x 125)Il calcolatore di coefficiente di estinzione richiede il numero esatto di ponti disolfuro come dato indipendente.
Integrazione nel flusso analitico
La sequenza tipica consiste nel calcolare il coefficiente dalla sequenza, misurare l assorbanza a 280 nm e ricavare la concentrazione molare. La guida alla conversione delle unita di peptidi spiega come convertire tali valori in concentrazioni di massa su volume.
Limiti analitici da ricordare
La spettrofotometria a 280 nm rileva unicamente Trp, Tyr e cistina. Sequenze prive di questi residui daranno un assorbimento prossimo allo zero indipendentemente dalla quantita reale di peptide in soluzione.
In sintesi, la legge di Beer-Lambert A = e x c x l permette di calcolare una concentrazione incognita con c = A / (e x l), una volta noti il coefficiente di estinzione molare e il cammino ottico.
Letteratura scientifica e riferimenti
- Gill, S. C., & von Hippel, P. H. (1989). Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Analytical Biochemistry, 182(2), 319-326. PubMed PMID: 2610349. DOI: 10.1016/0003-2697(89)90602-7. Definizione dei coefficienti standard a 280 nm.
- Pace, C. N., Vajdos, F., et al. (1995). How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein. Protein Science, 4(11), 2411-2423. PubMed PMID: 8563639. Validazione sperimentale in condizioni denaturanti.
- Edelhoch, H. (1967). Spectroscopic determination of tryptophan and tyrosine in proteins. Biochemistry, 6(7), 1948-1954. PubMed PMID: 6049437. Caratterizzazione spettroscopica di amminoacidi aromatici.
- IUPAC Compendium of Chemical Terminology (Gold Book). Definizione della legge di Beer-Lambert e coefficiente di attenuazione molare. Pure and Applied Chemistry, 1996.