A absorbância UV a 280 nanômetros é o método analítico padrão para estimar a concentração de um peptídeo em solução. Este artigo detalha a equação fundamental, seus rearranjos e como o coeficiente de extinção molar é calculado a partir da sequência de aminoácidos.
O que é a lei de Beer-Lambert?
A lei de Beer-Lambert estabelece a proporção entre absorbância, concentração molar, comprimento do caminho óptico e o coeficiente de extinção característico da molécula:
A = e x c x londe A é a absorbância (adimensional), e (épsilon) é o coeficiente de extinção molar em M^-1 cm^-1, c é a concentração molar em mol/L, e l é o caminho óptico em centímetros (usualmente 1 cm numa cubeta padrão).
A calculadora de absorbância Beer-Lambert determina A diretamente a partir de e, c e l.
Resolvendo para concentração molar
Na prática experimental de bancada, a absorbância é o valor medido no espectrofotômetro e a concentração é a variável procurada:
c = A / (e x l)A calculadora de concentração Beer-Lambert executa essa divisão fornecendo a molaridade correspondente.
Resolvendo para caminho óptico
l = A / (e x c)A calculadora de caminho óptico Beer-Lambert soluciona esta terceira variante algébrica.
Origem do coeficiente de extinção molar
A 280 nm, a absorção óptica decorre de resíduos aromáticos e pontes dissulfeto: triptofano, tirosina e cistina. Seus coeficientes molares individuais são:
Trp: 5500 M^-1 cm^-1
Tyr: 1490 M^-1 cm^-1
cistina: 125 M^-1 cm^-1Estes valores foram determinados por Gill e von Hippel (1989) e validados por Pace et al. (1995). O coeficiente global da sequência é calculado por:
e = (contagem Trp x 5500) + (contagem Tyr x 1490) + (pares de cistina x 125)A calculadora de coeficiente de extinção solicita o número exato de pontes dissulfeto como entrada independente.
Integração na rotina laboratorial
O procedimento habitual consiste em calcular o coeficiente a partir da sequência, medir a absorbância a 280 nm e determinar a concentração molar. O guia de conversão de unidades de peptídeos explica como converter essas leituras molares em concentração de massa por volume.
Limites do método analítico
A leitura a 280 nm só detecta Trp, Tyr e cistina. Peptídeos curtos desprovidos desses aminoácidos apresentarão absorbância nula, exigindo métodos colorimétricos como BCA ou Bradford.
Em resumo
A lei de Beer-Lambert, A = e x c x l, permite isolar a concentração molar de um peptídeo como c = A / (e x l) uma vez conhecido seu coeficiente de extinção molar a 280 nm.
Literatura científica e referências primárias
- Gill, S. C., & von Hippel, P. H. (1989). Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Analytical Biochemistry, 182(2), 319-326. PubMed PMID: 2610349. DOI: 10.1016/0003-2697(89)90602-7. Definição dos coeficientes aditivos a 280 nm.
- Pace, C. N., Vajdos, F., et al. (1995). How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein. Protein Science, 4(11), 2411-2423. PubMed PMID: 8563639. Validação experimental em condições desnaturantes.
- Edelhoch, H. (1967). Spectroscopic determination of tryptophan and tyrosine in proteins. Biochemistry, 6(7), 1948-1954. PubMed PMID: 6049437. Espectroscopia de aminoácidos aromáticos.
- IUPAC Compendium of Chemical Terminology (Gold Book). Lei de Beer-Lambert e coeficiente de atenuação molar. Pure and Applied Chemistry, 1996.