Calculadora de absorbancia de Beer-Lambert

A imagem que a lei descreve é um feixe colimado que entra numa solução homogénea e sai dela mais fraco. A luz é retirada por moléculas absorventes, e o número que um feixe transmite ao atravessar é proporcional à distância que percorre, que é o comprimento de trajeto. Multiplique isso pelo número de moléculas presentes por unidade de volume e tem algo proporcional à absorbância, e a constante de proporcionalidade é o coeficiente de extinção. Esse único número faz três coisas ao mesmo tempo, já que reúne o comprimento de onda, a identidade e a contagem dos grupos absorventes, e o solvente em que estão. A calculadora de coeficiente de extinção trata da parte desse constante que é o peptídeo.

Uma consequência que vale a pena reter é que a absorbância não tem unidades nenhuma. A transmitância é uma razão de duas intensidades e é portanto adimensional, e a absorbância é o seu logaritmo negativo, herdando essa propriedade. A lei é dimensionalmente consistente só por causa disso: os centímetros molares inversos do coeficiente, os mol por litro da concentração e os centímetros do comprimento de trajeto cancelam exatamente, deixando um número puro que um espectrofotómetro pode mostrar sem unidade associada. Uma leitura de 0.4 e uma de 40 não são portanto duas concentrações diferentes por acaso; são duas transmitâncias, e o visor não dá nenhuma pista de qual delas está a ver.

A lei é uma equação com quatro grandezas, portanto quaisquer três delas determinam a quarta. Esta página isola a absorbância. A calculadora de concentração isola a concentração e a calculadora de comprimento de trajeto isola o comprimento de trajeto. A matemática é idêntica nas três disposições e as suposições por baixo delas também, portanto uma discordância entre as três só pode ter vindo de uma entrada, nunca da forma como a equação foi reorganizada. Vale a pena saber isso quando um resultado parece errado, porque restringe a busca aos números e não à fórmula, e é também a razão por que uma ida e volta por quaisquer duas das três páginas é uma verificação legítima de toda uma cadeia de aritmética anterior.

A definição logarítmica é onde mora quase toda a confusão, e vale a pena fazer uma conversão como deve ser em vez de confiar no instinto. Numa absorbância de 0.055 a transmitância é dez elevado a menos 0.055, que é aproximadamente 0.88, portanto cerca de 88 por cento da luz incidente ainda chega ao lado oposto da cuvette. Essa é uma afirmação genuinamente útil, porque diz que a amostra está a absorver muito pouco do feixe, que é exatamente a condição em que uma leitura é frágil e não sólida.

Também significa que um pequeno movimento na absorbância é um grande movimento na luz. Uma absorbância de 1 deixa um décimo da luz, 2 deixa uma centésima, e 3 deixa uma milésima. Reduzir a concentração para metade acrescenta portanto 0.3 à absorbância em vez de a reduzir para metade, porque a concentração e a absorbância nunca estiveram na mesma escala. Os instrumentos são normalmente lineares na luz transmitida numa janela limitada, e não lineares na absorbância em todo o alcance, que é a razão pela qual uma leitura perto do topo da escala utilizável é a que merece desconfiança.

Para peptídeos há uma versão prática disto que é mais sobre onde apontar do que sobre onde evitar. Uma absorbância prevista de cerca de 0.4 é uma leitura confortável com folga de um lado e do outro. Um valor previsto de 0.04 está perto do que um instrumento de bancada consegue resolver, e um previsto de 0.004 é indistinguível de um branco. Quando conhece o coeficiente e a concentração de antemão, esta página diz-lhe qual desses três casos é o seu antes de pegar numa cuvette, e o guia sobre arredondamento e volumes pequenos cobre o que acontece a um número pequeno depois de escrito.

A lei sobrevive a uma gama larga precisamente porque as moléculas individuais absorvem de forma independente umas das outras. Ela quebra onde essa independência falha, e as causas comuns são físicas e não químicas. A dispersão e a turbidez desviam luz para fora do feixe sem a absorver, e no entanto a maioria dos instrumentos não tem maneira de distinguir absorvância de desvio e comunica o valor maior, pelo que uma amostra turva ou com partículas lê como mais concentrada do que é. O trabalho sobre Beer Lambert cobre as verificações que apanham isto antes de um resultado ser acreditado. Uma solução que parece perfeitamente clara a olho nu pode ainda ter partículas suficientemente pequenas para dispersar, portanto a clareza não é o teste e uma inspecção visual também não.

A luz espúria empurra no sentido oposto e é a razão pela qual uma amostra perfeitamente boa pode aparecer como sem concentração mensurável. Qualquer luz que chegue ao detetor sem passar pela amostra acrescenta-se à leitura de uma forma que a razão não consegue ver. Em absorbâncias baixas o instrumento acredita portanto que passou mais luz do que passou de facto, subestima a absorbância e comunica uma concentração demasiado baixa. Diluir ainda mais para compensar piora a discrepância em vez de a melhorar. O erro encolhe à medida que o sinal cresce, o que é outra forma de dizer que o problema não é a lei mas a razão entre uma grandeza muito pequena e o desvio do instrumento.

Uma alteração na própria amostra é a terceira causa e a mais difícil de detectar. Um peptídeo que agrega em partículas já não é um conjunto de moléculas independentes, e um que se adsorveu ao vidro já não está todo em solução. Ambas alteram a relação entre concentração e absorbância, e nenhuma se anuncia na saída, que continua a parecer uma banda de absorção limpa com um número plausível ao lado. A maneira fiável de a expor é uma série de diluições conhecidas: uma relação linear ao longo da série significa que a lei está a valer nesse alcance, e uma curva significa que não está.

O uso mais económico desta página é como uma previsão que se confere contra um instrumento e não como um cálculo que substitui um instrumento. Preveja a absorbância, depois faça a leitura. Se concordarem, o coeficiente, a concentração e o comprimento de trajeto são mutuamente consistentes, o que faz deste o teste mais barato de toda uma cadeia de aritmética. Se discordarem, a dimensão e a direção da falha dizem-lhe qual é a entrada a suspeitar antes de mudar seja o que for, e muitas vezes a resposta é simplesmente que a amostra estava mais diluída do que o cálculo supunha. Para o lado da concentração nessa comparação, a calculadora de molaridade é de onde vem a figura molar.

Correr as três calculadoras deste site como uma ida e volta aplica a mesma ideia aos números em vez de ao instrumento. Pegue numa absorbância, introduza-a na calculadora de concentração, e ela deve devolver o valor de que partiu. A calculadora de comprimento de trajeto faz o mesmo com o comprimento de trajeto. Juntas isolam qual das quatro grandezas não é o que se pensa, o que é uma abordagem consideravelmente mais eficiente do que ajustar entradas até a resposta parecer razoável. Apanham também o erro específico que é mais difícil de apanhar a olho, que é uma concentração ou um coeficiente introduzidos na unidade errada e depois analisados perfeitamente por uma página que não tinha motivo para se queixar.