Calculateur d'absorbance de Beer-Lambert

L’image que la loi décrit est un faisceau collimaté qui entre dans une solution homogène et qui en sort affaibli. La lumière est retirée par des molécules absorbantes, et le nombre de molécules qu’un faisceau rencontre sur son trajet est proportionnel à la distance qu’il parcourt, qui est la longueur de trajet. Multipliez cela par le nombre de molécules présentes par unité de volume et vous obtenez une grandeur proportionnelle à l’absorbance, et la constante de proportionnalité est le coefficient d’extinction. Ce nombre unique fait trois choses à la fois, puisqu’il réunit la longueur d’onde, l’identité et le nombre des groupes absorbants, et le solvant dans lequel ils se trouvent. Le calculateur de coefficient d’extinction s’occupe de la partie peptide de cette constante.

Une conséquence qu’il faut retenir est que l’absorbance ne porte aucune unité. La transmittance est un rapport de deux intensités et est donc sans dimension, et l’absorbance en est le logarithme négatif, si bien qu’elle hérite de cette propriété. La loi n’est cohérente dimensionnellement que grâce à cela : les centimètres molaires inverses du coefficient, les moles par litre de la concentration et les centimètres de la longueur de trajet s’annulent exactement, ne laissant qu’un nombre pur qu’un spectrophotomètre peut afficher sans unité. Un affichage de 0.4 et un affichage de 40 ne sont donc pas deux concentrations différentes par hasard ; ce sont deux transmittances, et l’affichage ne donne aucun indice de celle que vous êtes en train de regarder.

La loi est une équation qui contient quatre grandeurs, donc trois quelconques déterminent la quatrième. Cette page isole l’absorbance. Le calculateur de concentration isole la concentration et le calculateur de longueur de trajet isole la longueur de trajet. Les mathématiques sont identiques dans les trois dispositions, et les hypothèses qui les sous-tendent le sont aussi, si bien qu’un désaccord entre les trois ne peut venir que d’une entrée, jamais de la façon dont l’équation a été réarrangée. Cela vaut la peine d’être connu quand un résultat paraît faux, parce que cela réduit la recherche aux nombres plutôt qu’à la formule, et c’est aussi pourquoi un aller-retour par deux quelconques de ces trois pages constitue un contrôle légitime de toute une chaîne d’arithmétique antérieure.

La définition logarithmique est le lieu de la plupart des confusions, et il vaut mieux faire une conversion correctement plutôt que de se fier à l’intuition. À une absorbance de 0.055, la transmittance vaut dix à la puissance moins 0.055, ce qui donne environ 0.88, donc environ 88 pour cent de la lumière incidente atteignent encore le côté opposé de la cuve. C’est un énoncé réellement utile, parce qu’il dit que l’échantillon absorbe très peu de lumière, et c’est exactement la condition sous laquelle une lecture est fragile plutôt que solide.

Cela signifie aussi qu’un petit déplacement de l’absorbance est un grand déplacement de la lumière. Une absorbance de 1 laisse un dixième de la lumière, 2 laisse un centième, et 3 laisse un millième. L’absorbance elle-même, en revanche, est linéaire en concentration, si bien que diviser la concentration par deux divise bien l’absorbance par deux, et c’est exactement ce que la loi énonce. C’est la transmittance qui se comporte mal : diviser par deux la lumière qui atteint le détecteur modifie l’absorbance de log 10 de 2, soit environ 0.301, si bien que des pas égaux en transmittance sont des pas égaux en absorbance, alors que l’inverse n’est vrai nulle part. Les instruments sont en général linéaires en lumière transmise sur une fenêtre limitée plutôt que linéaires en absorbance sur toute la plage, et c’est la raison pour laquelle une lecture proche du haut de l’échelle utilisable est précisément celle qui mérite le doute.

Pour les peptides, il existe une version pratique de cela qui relève de l’endroit où viser plutôt que de l’endroit à éviter. Une absorbance prévue d’environ 0.4 est une lecture confortable, avec de la marge des deux côtés. Une absorbance prévue de 0.04 est proche de ce qu’un instrument de paillasse peut résoudre, et une absorbance prévue de 0.004 est indiscernable d’un blanc. Quand vous connaissez le coefficient et la concentration à l’avance, cette page vous dit dans lequel de ces trois cas vous êtes avant même de prendre une cuve, et le guide sur l’arrondi et les petits volumes couvre ce qu’il advient d’un petit nombre une fois qu’il est écrit.

La loi survit à une large plage précisément parce que les molécules individuelles absorbent indépendamment les unes des autres. Elle casse partout où cette indépendance fait défaut, et les causes courantes sont physiques plutôt que chimiques. La diffusion de la lumière et la turbidité dévient la lumière hors du faisceau sans l’absorber, et pourtant la plupart des instruments n’ont aucun moyen de distinguer l’absorption de la déviation et rapportent le chiffre le plus élevé, si bien qu’un échantillon trouble ou particulaire affiche une concentration supérieure à la réalité. Le travail sur Beer-Lambert couvre les contrôles qui rattrapent cela avant qu’un résultat ne soit digne de confiance. Une solution qui paraît parfaitement claire à l’œil peut encore porter des particules assez fines pour diffuser, si bien que la clarté n’est pas le test et qu’un contrôle visuel n’en est pas un.

La lumière parasite pousse dans l’autre sens, et c’est la raison pour laquelle un échantillon parfaitement bon peut sembler n’avoir aucune concentration mesurable. Toute lumière qui atteint le détecteur sans être passée par l’échantillon s’ajoute à la lecture d’une manière que le rapport ne peut pas voir. À faible absorbance, l’instrument croit donc que plus de lumière est passée qu’il n’en est réellement passé, sous-estime l’absorbance, et annonce une concentration trop basse. Diluer davantage pour compenser aggrave l’écart au lieu de l’améliorer. L’erreur diminue quand le signal augmente, ce qui est une autre façon de dire que le problème n’est pas la loi, mais le rapport d’une très petite grandeur à un décalage de l’instrument.

Un changement dans l’échantillon lui-même est la troisième cause et la plus difficile à repérer. Un peptide qui s’agrège en particules n’est plus un ensemble de molécules indépendantes, et un peptide qui s’est adsorbé sur le verre n’est plus entièrement en solution. Les deux modifient la relation entre la concentration et l’absorbance, et aucun ne se signale dans la sortie, qui ressemble toujours à une bande d’absorption propre avec un chiffre plausible attaché. La manière fiable de l’exposer est une série de dilutions connues : une relation linéaire sur toute la série signifie que la loi tient sur cette plage, et une courbe signifie qu’elle ne tient pas.

L’usage le plus économique de cette page est celui d’une prédiction que l’on confronte à un instrument, et non celui d’un calcul qui en remplace un. Prévoyez l’absorbance, puis prenez la mesure. Si elles concordent, le coefficient, la concentration et la longueur de trajet sont mutuellement cohérents, ce qui fait de ceci le test le moins coûteux de toute une chaîne d’arithmétique. Si elles divergent, la taille et le sens de l’écart vous disent quelle entrée suspecter avant de changer quoi que ce soit, et la réponse est souvent simplement que l’échantillon était plus dilué que le calcul ne le supposait. Pour le versant concentration de cette comparaison, c’est le calculateur de molarité qui fournit le chiffre molaire.

Faire tourner les trois calculateurs de ce site en aller-retour applique la même idée aux nombres plutôt qu’à l’instrument. Prenez une absorbance, passez-la au calculateur de concentration, et elle doit ressortir comme la valeur de départ. Le calculateur de longueur de trajet fait de même avec la longueur de trajet. À eux deux, ils isolent laquelle des quatre grandeurs n’est pas ce que vous croyiez, ce qui est une approche nettement plus efficace que d’ajuster les entrées jusqu’à ce que la réponse paraisse raisonnable. Cela attrape aussi l’erreur précise la plus difficile à repérer à l’œil, à savoir une concentration ou un coefficient saisi dans la mauvaise unité puis analysé parfaitement par une page qui n’avait aucune raison de protester.