Calcolatore dell'assorbanza di Beer-Lambert

L’immagine che la legge descrive è un fascio collimato che entra in una soluzione omogenea e ne esce più debole. La luce viene rimossa da molecole che assorbono, e il numero di fotoni che un fascio fa passare lungo il percorso è proporzionale alla distanza percorsa, che è la lunghezza del percorso ottico. Moltiplica quella per quanti sono le molecole presenti per unità di volume e ottieni qualcosa di proporzionale all’assorbanza, e la costante di proporzionalità è il coefficiente di estinzione. Quell’unico numero fa tre lavori in una volta, perché racchiude in sé la lunghezza d’onda, l’identità e il numero dei gruppi assorbenti e il solvente in cui si trovano. Il calcolatore del coefficiente di estinzione gestisce la parte del peptide di quella costante.

Una conseguenza da tenere a mente è che l’assorbanza non porta unità affatto. La trasmittanza è un rapporto fra due intensità ed è quindi adimensionale, e l’assorbanza è il suo logaritmo con segno negativo, quindi eredita quella proprietà. La legge è dimensionalmente coerente solo per questa ragione: i centimetri molari inversi del coefficiente, le moli per litro della concentrazione e i centimetri della lunghezza del percorso ottico si semplificano esattamente, lasciando un numero puro che uno spettrofotometro può mostrare senza unità attaccata. Una lettura di 0.4 e una di 40 non sono quindi due concentrazioni diverse per caso: sono due trasmittanze, e il display non dà alcun indizio di quale delle due tu stia guardando.

La legge è un’equazione che contiene quattro grandezze, quindi qualunque tre di esse determinano la quarta. Questa pagina isola l’assorbanza. Il calcolatore della concentrazione con la legge di Beer-Lambert isola la concentrazione e il calcolatore del percorso ottico con la legge di Beer-Lambert isola la lunghezza del percorso ottico. La matematica è identica nelle tre sistemazioni e le ipotesi sotto di esse sono identiche anch’esse, quindi un disaccordo fra le tre può essere venuto soltanto da un dato di ingresso, mai da come l’equazione è stata riordinata. Vale la pena saperlo quando un risultato sembra sbagliato, perché restringe la ricerca ai numeri e non alla formula, ed è anche il motivo per cui un viaggio di andata e ritorno attraverso qualunque coppia delle tre pagine è un controllo legittimo su un’intera catena di aritmetica precedente.

La definizione logaritmica è il posto in cui vive quasi tutta la confusione, e vale la pena fare bene una conversione invece di fidarsi dell’intuizione. A un’assorbanza di 0.055 la trasmittanza è dieci elevato a meno 0.055, che è circa 0.88, quindi circa l’88 per cento della luce incidente raggiunge ancora il lato opposto della cuvetta. È un’affermazione genuinamente utile, perché dice che il campione assorbe pochissima parte del fascio, che è esattamente la condizione nella quale una lettura è fragile e non solida.

Significa anche che un piccolo spostamento dell’assorbanza è un grande spostamento della luce. Un’assorbanza di 1 lascia un decimo della luce, 2 ne lascia un centesimo e 3 ne lascia un millesimo. L’assorbanza in sé è invece lineare nella concentrazione, quindi dimezzare la concentrazione dimezza davvero l’assorbanza, ed è esattamente ciò che la legge afferma. È la trasmittanza a comportarsi male: dimezzare la luce che raggiunge il rivelatore cambia l’assorbanza di log 10 di 2, circa 0.301, quindi passi uguali in trasmittanza corrispondono a passi uguali in assorbanza mentre il contrario non è affatto vero. Gli strumenti sono di solito lineari nella luce trasmessa su una finestra limitata anziché lineari nell’assorbanza su tutto il campo, ed è per questo che una lettura vicino al limite alto della scala utilizzabile è quella che merita sospetto.

Per i peptidi esiste una versione pratica di questo che riguarda dove mirare e non dove evitare. Un’assorbanza prevista attorno a 0.4 è una lettura comoda con margine da entrambe le parti. Un valore previsto di 0.04 è vicino a quanto uno strumento da banco riesce a risolvere, e un valore previsto di 0.004 è indistinguibile da un bianco. Quando conosci in anticipo il coefficiente e la concentrazione, questa pagina ti dice quale dei tre sei prima di prendere in mano una cuvetta, e la guida all’arrotondamento e ai piccoli volumi copre che cosa accade a un numero piccolo una volta scritto.

La legge sopravvive a un intervallo ampio precisamente perché le molecole individuali assorbono indipendentemente l’una dall’altra. Si rompe ovunque quella indipendenza fallisce, e le cause comuni sono fisiche e non chimiche. La diffusione e la torbidità deviano la luce fuori dal fascio senza assorbirla, eppure la maggior parte degli strumenti non ha modo di distinguere l’assorbimento dalla deviazione e riporta la cifra più alta, quindi un campione torbido o particolato segna come più concentrato di quanto sia. Il lavoro su Beer-Lambert copre i controlli che intercettano il problema prima di fidarsi di un risultato. Una soluzione che all’occhio sembra perfettamente limpida può comunque contenere particelle abbastanza piccole da diffondere la luce, quindi la limpidezza non è il test e un controllo a vista non lo è.

La luce dispersa spinge nella direzione opposta ed è il motivo per cui un campione perfettamente valido può apparire privo di concentrazione misurabile. Qualunque luce che raggiunga il rivelatore senza passare attraverso il campione si somma alla lettura in un modo che il rapporto non può vedere. A bassa assorbanza lo strumento crede quindi che sia passata più luce di quanta ne sia davvero passata, sottostima l’assorbanza e riporta una concentrazione troppo bassa. Diluire ulteriormente per compensare peggiora la discrepanza invece di migliorarla. L’errore diminuisce quando il segnale cresce, che è un altro modo di dire che il problema non è affatto la legge ma il rapporto fra una grandezza molto piccola e una deriva dello strumento.

Una variazione nel campione stesso è la terza causa e la più difficile da individuare. Un peptide che aggrega in particelle non è più un insieme di molecole indipendenti, e uno che si è adsorbito sul vetro non è più tutto in soluzione. Entrambi alterano la relazione fra concentrazione e assorbanza, e nessuno dei due si annuncia nell’uscita, che continua a sembrare una banda di assorbimento pulita con un numero plausibile attaccato. Il modo affidabile per esporla è una serie di diluizioni note: una relazione lineare lungo la serie significa che la legge vale su quell’intervallo, e una curva significa che non vale.

L’uso più economico di questa pagina è come previsione da confrontare con uno strumento, non come calcolo che ne sostituisce uno. Prevedi l’assorbanza, poi prendi la lettura. Se concordano, il coefficiente, la concentrazione e la lunghezza del percorso ottico sono mutuamente coerenti, il che rende questa la prova più economica disponibile su un’intera catena di aritmetica. Se non concordano, la dimensione e la direzione dello scarto ti dicono quale ingresso sospettare prima di cambiare qualcosa, e spesso la risposta è semplicemente che il campione era più diluito di quanto il calcolo assumesse. Per il lato molare di quel confronto, il calcolatore della molarità è donde proviene la cifra molare.

Far girare i tre calcolatori di questo sito come viaggio di andata e ritorno applica la stessa idea ai numeri invece che allo strumento. Prendi un’assorbanza, passala al calcolatore della concentrazione, e dovrebbe tornare come il valore da cui sei partito. Il calcolatore del percorso ottico fa lo stesso con la lunghezza. Fra loro isolano quale delle quattro grandezze non è quella che credevi, il che è un approccio parecchio più efficiente che aggiustare gli ingressi finché la risposta non sembra ragionevole. Intercetta anche l’errore specifico più difficile da scorgere a occhio, che è una concentrazione o un coefficiente inserito nell’unità sbagliata e poi interpretato perfettamente da una pagina che non aveva motivo di protestare.