Calcolatore della curva carica vs pH

Ogni gruppo che può guadagnare o perdere un protone contribuisce con un gradino centrato sul proprio pKa, che sale per un gruppo che si protona mentre il pH scende e scende per un gruppo che perde il protone. La curva tracciata è la somma aritmetica di quei gradini con il segno che ciascun gruppo porta, quindi la forma del tutto è una lettura di quanti gruppi esistono e di quanto distano fra loro i rispettivi pKa. Un gruppo il cui pKa sta in una regione dove non c’è altro produce un gradino netto tutto suo. Due gruppi con pKa vicini producono un gradino che sembra un evento solo e ne è in realtà due.

Ecco perché il numero di gradini visibili è di solito minore del numero di gruppi ionizzabili. I gruppi carbossilici di un peptide tipico stanno abbastanza vicini da fondersi, e chi conta tre gradini sulla curva e conclude che esistono tre gruppi ha probabilmente sotto contato. Il calcolatore della carica netta conta i gruppi esplicitamente, includendo ogni pKa tabulato, ed è il modo più affidabile di stabilire quanti ce ne siano. La guida alla carica netta del peptide e a Henderson-Hasselbalch espone l’aritmetica per gruppo da cui nascono questi gradini.

La curva qui è campionata in 29 valori di pH equidistanti su un intervallo di 14, cioè un punto ogni mezza unità di pH. Basta per mostrare dove sono le transizioni e per localizzare l’attraversamento entro circa un decimo di unità di pH. Non basta per risolvere il profilo di una transizione molto netta. Un gradino campionato quattro volte può sembrare morbido quando il cambiamento fra campioni adiacenti è grande, e due gradini ravvicinati possono cadere interamente fra due punti di campionamento.

La cosa conta soprattutto perché il grafico e il risolutore dedicato non sono altrettanto precisi sulla stessa grandezza, e chi li confronta può sospettare un difetto in uno dei due. Il grafico mostra l’attraversamento in modo approssimato, perché ne eredita l’intervallo di campionamento. Il calcolatore del punto isoelettrico non campiona: racchiude la radice e dimezza l’intervallo finché la carica residua è trascurabile, quindi restituisce l’attraversamento con una cifra molto più fine. Se i due differiscono più di quanto consenta l’intervallo di campionamento, è la sequenza da reinserire, non l’aritmetica da mettere in dubbio.

La ripidezza della curva è informativa perché è una lettura diretta di quanta carica cambia per unità di pH, cioè di quanti gruppi si trovano contemporaneamente nella loro regione sensibile. Un solo gruppo che si trovi al proprio pKa contribuisce con una pendenza di picco di circa 0.58 di carica per unità di pH. Due gruppi con pKa vicini si sommano, e la curva si irrigidisce oltre qualunque cosa un solo gruppo possa produrre da solo. Quel tratto ripido è l’intervallo di pH nel quale la risposta della pagina sulla carica netta è più sensibile a un errore nel pH inserito.

Anche i tratti piatti meritano di essere letti. Lontano da ogni pKa, aggiungere un decimo di unità di pH cambia ben poco, il che rende quelle regioni indulgenti e le ripide esatte nel modo descritto sopra. Spiega anche l’inclinazione complessiva: la curva non è simmetrica rispetto al suo centro, perché i gruppi acidi stanno in basso e i gruppi basici in alto, quindi le due metà dell’intervallo contribuiscono con quantità di carica diverse. Quell’asimmetria è la composizione della sequenza che traspare, e la spiegazione del punto isoelettrico del peptide copre lo stesso terreno dal lato del pI.

Agli estremi la curva si avvicina a valori semplici da interpretare. A pH molto basso quasi ogni gruppo è protonato, quindi la carica si avvicina al numero di gruppi basici che il modello conta, estremità N compresa. A pH molto alto quasi ogni gruppo ha perso il protone, quindi si avvicina all’opposto del numero di gruppi acidi, estremità C compresa. L’ampiezza verticale fra i due limiti è dunque il numero totale di gruppi ionizzabili del modello, e leggerla è un controllo rapido per verificare che la sequenza sia quella che credi che sia.

Quei limiti sono avvicinati e non raggiunti, e 29 campioni non bastano per arrivarci. Una curva che sembra fermarsi a più uno potrebbe semplicemente finire a pH 0.0, e il residuo a uno dei due estremi è aritmetica reale e non un artefatto del grafico. Le condizioni di tampone in cui un certo punto della curva si realizza sono una domanda separata e un calcolo separato, ed è a questo che serve il calcolatore di diluizione del tampone . La curva descrive la molecola; raggiungere un pH scelto è un problema pratico che la curva non risolve.