La loi de Beer-Lambert relie l absorbance à la concentration d un peptide par A = e x c x l, où e est le coefficient d extinction molaire, c la concentration molaire et l la longueur de la cuve. Mesurée à 280 nanomètres, l absorbance UV permet ainsi de calculer directement la concentration d une solution de peptide.
La relation physique
La loi de Beer-Lambert relie l absorbance optique à la concentration molaire, à la longueur du trajet optique et au coefficient d extinction spécifique du peptide:
A = e x c x loù A est l absorbance (sans dimension), e (epsilon) est le coefficient d extinction molaire en M^-1 cm^-1, c est la concentration molaire en mol/L, et l est la longueur de la cuve en centimètres (usuellement 1 cm).
Le calculateur d absorbance Beer-Lambert calcule A directement lorsque e, c et l sont connus.
Comment calculer la concentration d un peptide par la loi de Beer-Lambert ?
Dans la pratique de laboratoire, l absorbance est la grandeur mesurée et la concentration est l inconnue:
c = A / (e x l)Le calculateur de concentration Beer-Lambert effectue cette division après saisie du coefficient et du trajet optique.
Résolution pour le trajet optique
Lorsque la longueur de cuve est recherchée:
l = A / (e x c)Le calculateur de longueur de trajet Beer-Lambert couvre cette variante. Les trois outils partagent la même équation physique.
Origine du coefficient d extinction molaire
À 280 nm, l absorbance dépend des chaînes aromatiques et des ponts disulfures: le tryptophane, la tyrosine et la cystine. Leurs coefficients individuels sont:
Trp: 5500 M^-1 cm^-1
Tyr: 1490 M^-1 cm^-1
cystine: 125 M^-1 cm^-1Ces valeurs proviennent de Gill et von Hippel (1989) ainsi que Pace et al. (1995). Le coefficient global de la séquence est calculé ainsi:
e = (nombre Trp x 5500) + (nombre Tyr x 1490) + (paires de cystine x 125)Le calculateur de coefficient d extinction demande le nombre de ponts disulfures comme paramètre distinct.
Enchaînement des étapes au laboratoire
Le flux analytique classique consiste à déterminer le coefficient depuis la séquence, mesurer l absorbance à 280 nm, puis calculer la concentration molaire. Le guide de conversion des unités de peptides explique ensuite comment passer des unités molaires aux concentrations massiques.
Limites de détection importantes
Un spectromètre à 280 nm ne détecte que Trp, Tyr et les ponts disulfures. Une séquence dépourvue de ces trois résidus affichera une absorbance quasi nulle même en présence d une quantité importante de matière.
En résumé, la loi de Beer-Lambert A = e x c x l permet de calculer une concentration inconnue par c = A / (e x l) dès que le coefficient d extinction molaire et la longueur de cuve sont connus.
Littérature scientifique et références
- Gill, S. C., & von Hippel, P. H. (1989). Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Analytical Biochemistry, 182(2), 319-326. PubMed PMID: 2610349. DOI: 10.1016/0003-2697(89)90602-7. Publication fondatrice établissant les coefficients molaires à 280 nm.
- Pace, C. N., Vajdos, F., et al. (1995). How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein. Protein Science, 4(11), 2411-2423. PubMed PMID: 8563639. Validation en conditions dénaturantes.
- Edelhoch, H. (1967). Spectroscopic determination of tryptophan and tyrosine in proteins. Biochemistry, 6(7), 1948-1954. PubMed PMID: 6049437. Profils d absorption des acides aminés aromatiques.
- IUPAC Compendium of Chemical Terminology (Gold Book). Entrée loi de Beer-Lambert et coefficient d atténuation molaire. Pure and Applied Chemistry, 1996.