पेप्टाइड सांद्रता 280 nm पर अवशोषण से A = e x c x l सूत्र द्वारा निकाली जाती है, जिसे c = A / (e x l) में बदलकर हल किया जाता है: A मापा गया अवशोषण है, e मोलर विलोपन गुणांक और l क्युवेट की पथ लंबाई (आमतौर पर 1 सेमी)।
मूल समीकरण
बीयर-लैम्बर्ट नियम अवशोषण, मोलर सांद्रता, प्रकाश पथ की लंबाई और विशिष्ट मोलर विलोपन गुणांक के बीच सीधा संबंध स्थापित करता है:
A = e x c x lजहाँ A अवशोषण (स्पेक्ट्रोफोटोमीटर से प्राप्त मात्रक-रहित मान) है, e (एप्सिलॉन) मोलर विलोपन गुणांक (M^-1 cm^-1) है, c मोलर सांद्रता (mol/L) है, और l सेंटीमीटर में पथ लंबाई है (मानक कुवेट में आमतौर पर 1 सेमी)।
बीयर-लैम्बर्ट अवशोषण कैलकुलेटर e, c और l के ज्ञात होने पर सीधे A की गणना करता है।
अवशोषण से पेप्टाइड सांद्रता कैसे निकालें?
प्रयोगशाला में अक्सर अवशोषण मापा जाता है और सांद्रता अज्ञात होती है:
c = A / (e x l)बीयर-लैम्बर्ट सांद्रता कैलकुलेटर इस विभाजन को निष्पादित करके रीडिंग को मोलर सांद्रता में बदलता है।
पथ लंबाई (Path Length) ज्ञात करना
l = A / (e x c)बीयर-लैम्बर्ट पथ लंबाई कैलकुलेटर इस तीसरे रूपांतरण को हल करता है।
विलोपन गुणांक (Extinction Coefficient) कहाँ से आता है
280 nm पर अवशोषण मुख्य रूप से तीन एरोमैटिक और डाइसल्फाइड अवशेषों से आता है: ट्रिप्टोफैन, टायरोसिन और सिस्टीन। इनके मानक मान हैं:
Trp: 5500 M^-1 cm^-1
Tyr: 1490 M^-1 cm^-1
सिस्टीन: 125 M^-1 cm^-1यह मान गिल और वॉन हिपेल (1989) तथा पेस एवं अन्य (1995) द्वारा निर्धारित किए गए हैं। अनुक्रम का कुल गुणांक निम्न प्रकार निकाला जाता है:
e = (Trp संख्या x 5500) + (Tyr संख्या x 1490) + (सिस्टीन जोड़े x 125)विलोपन गुणांक कैलकुलेटर डाइसल्फाइड बंधों की संख्या अलग से दर्ज करने की सुविधा देता है।
व्यावहारिक प्रयोगशाला चरण
सामान्य प्रक्रिया यह है: अनुक्रम से गुणांक निकालें, 280 nm पर अवशोषण मापें और फिर सांद्रता निकालें। पेप्टाइड यूनिट रूपांतरण गाइड मोलर सांद्रता को मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर में बदलने की विधि समझाती है।
महत्वपूर्ण विश्लेषणात्मक सीमाएँ
280 nm केवल Trp, Tyr और सिस्टीन का पता लगाता है। यदि किसी पेप्टाइड में यह तीनों अनुपस्थित हैं, तो घोल में पेप्टाइड होने पर भी अवशोषण शून्य दिखेगा।
संक्षेप में
संक्षेप में: c = A / (e x l) 280 nm पर मापे गए अवशोषण से मोलर पेप्टाइड सांद्रता सीधे निकालता है, बशर्ते Trp, Tyr और सिस्टीन से विलोपन गुणांक e ज्ञात हो।
वैज्ञानिक साहित्य और संदर्भ
- Gill, S. C., & von Hippel, P. H. (1989). Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Analytical Biochemistry, 182(2), 319-326. PubMed PMID: 2610349. 280 nm पर ट्रिप्टोफैन और टायरोसिन के मानक गुणांक।
- Pace, C. N., Vajdos, F., et al. (1995). How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein. Protein Science, 4(11), 2411-2423. PubMed PMID: 8563639. प्रोटीन गुणांकों का प्रयोगात्मक सत्यापन।
- Edelhoch, H. (1967). Spectroscopic determination of tryptophan and tyrosine in proteins. Biochemistry, 6(7), 1948-1954. PubMed PMID: 6049437. एरोमैटिक अमीनो एसिड का स्पेक्ट्रोस्कोपिक अध्ययन।
- IUPAC Compendium of Chemical Terminology (Gold Book). बीयर-लैम्बर्ट नियम परिभाषा। Pure and Applied Chemistry, 1996.