Die Peptidkonzentration aus UV-Absorption bei 280 nm berechnet sich nach A = e x c x l, aufgeloest nach c = A / (e x l): A ist die gemessene Absorption, e der molare Extinktionskoeffizient und l die Schichtdicke der Kuevette (meist 1 cm). Dieser Beitrag erklaert die Gleichung, ihre Umstellungen und wie e direkt aus der Aminosaeuresequenz abgeleitet wird.
Die physikalische Beziehung
Das Beer-Lambert-Gesetz setzt die gemessene Absorption ins Verhaeltnis zu Konzentration, optischer Weglaenge und stoffspezifischem Koeffizienten:
A = e x c x lHierbei ist A die dimensionslose Absorption, e (Epsilon) der molare Extinktionskoeffizient in M^-1 cm^-1, c die molare Konzentration in mol/L und l die Schichtdicke in Zentimetern (ueblicherweise 1 cm in Standardkuevetten).
Der Beer-Lambert-Absorptionsrechner berechnet A direkt aus den drei bekannten Parametern.
Wie berechnet man die Peptidkonzentration aus der Absorption?
In der taeglichen Laborpraxis ist die Absorption die gemessene Groesse und die Konzentration die gesuchte Unbekannte:
c = A / (e x l)Der Beer-Lambert-Konzentrationsrechner fuehrt diese Division aus und wandelt den Messwert in die molare Konzentration um.
Umstellung nach der optischen Schichtdicke
Wird die Schichtdicke gesucht:
l = A / (e x c)Der Beer-Lambert-Schichtdickenrechner loest diese Gleichung auf.
Herkunft des Extinktionskoeffizienten
Bei 280 nm absorbieren fast ausschliesslich aromatische Seitenketten und Disulfidbruecken: Tryptophan, Tyrosin und Cystin. Ihre individuellen Koeffizienten lauten:
Trp: 5500 M^-1 cm^-1
Tyr: 1490 M^-1 cm^-1
Cystin: 125 M^-1 cm^-1Diese Werte stammen von Gill und von Hippel (1989) sowie Pace et al. (1995). Der Gesamtkoeffizient ergibt sich als Summe:
e = (Anzahl Trp x 5500) + (Anzahl Tyr x 1490) + (Cystin-Paare x 125)Der Extinktionskoeffizienten-Rechner erfasst die Anzahl der Disulfidbruecken separat.
Praktischer Laborablauf
Der uebliche Ablauf: Koeffizienten aus der Sequenz berechnen, Absorption bei 280 nm messen, Konzentration berechnen. Die Peptid-Einheiten-Umrechnung Anleitung zeigt, wie man anschliessend in Massenkonzentrationen umrechnet.
Analytische Nachweisgrenzen
Bei 280 nm werden nur Trp, Tyr und Cystin erfasst. Sequenzen ohne diese Aminosaeuren zeigen keine Absorption, unabhaengig von der geloesten Peptidmenge. In solchen Faellen sind colorimetrische Tests (BCA, Bradford) erforderlich.
Zusammengefasst
Kurz gesagt: c = A / (e x l) liefert die molare Peptidkonzentration direkt aus der bei 280 nm gemessenen Absorption, sobald der Extinktionskoeffizient e aus dem Trp-, Tyr- und Cystin-Gehalt der Sequenz bekannt ist.
Wissenschaftliche Literatur und Zitate
- Gill, S. C., & von Hippel, P. H. (1989). Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Analytical Biochemistry, 182(2), 319-326. PubMed PMID: 2610349. DOI: 10.1016/0003-2697(89)90602-7. Standardwerte fuer Tryptophan, Tyrosin und Cystin.
- Pace, C. N., Vajdos, F., et al. (1995). How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein. Protein Science, 4(11), 2411-2423. PubMed PMID: 8563639. Experimentelle Pruefung an 80 Proteinen.
- Edelhoch, H. (1967). Spectroscopic determination of tryptophan and tyrosine in proteins. Biochemistry, 6(7), 1948-1954. PubMed PMID: 6049437. Spektroskopische Grundlagen aromatischer Aminosaeuren.
- IUPAC Compendium of Chemical Terminology (Gold Book). Beer-Lambert law. Pure and Applied Chemistry, 1996.