Calculadora do coeficiente de extincao

O coeficiente não é uma propriedade da molécula por si só. É uma propriedade da molécula num comprimento de onda, e é por isso que qualquer coeficiente citado em qualquer sítio traz o comprimento de onda ao lado e que um valor a 280 nanómetros não pode ser usado para interpretar uma leitura tomada a 214 nanómetros. O cálculo em si é uma contagem ponderada: cada triptofano acrescenta 5500, cada tirosina acrescenta 1490, e cada par de cisteínas unidas por dissulfeto acrescenta 125, tudo em centímetros molares inversos. A fenilalanina não acrescenta nada aqui, porque o seu anel absorve mais para dentro do ultravioleta do que o comprimento de onda normal.

O mais instrutivo dessa lista é quão pouca da sequência ela usa. Dois peptídeos do mesmo comprimento com o mesmo número de triptofanos e o mesmo número de pares de cistina devolvem um coeficiente idêntico, por mais completamente diferentes que sejam os seus restantes resíduos. Uma cadeia de resíduos ácidos e uma cadeia de resíduos básicos parecem iguais a este modelo. É isso que torna o número utilizável para uma medição de concentração e uma má descrição de uma molécula, e vale a pena saber qual das duas coisas se tem nas mãos antes de o usar.

O termo das ligações dissulfeto é a única entrada que não se lê numa sequência. Uma cisteína pode estar livre, emparelhada com uma segunda cisteína, ou ligada a outra coisa completamente diferente, e só a forma emparelhada contribui. Uma sequência de uma letra não distingue esses casos, portanto a contagem é fornecida à mão em vez de inferida, e é por isso que este campo existe neste formulário. Introduzir o número de cisteínas presume que todas elas encontraram uma parceira, e uma contagem ímpar torna isso impossível. A calculadora de aromaticidade conta os resíduos que puxam o resto do total.

Estes coeficientes foram medidos em material totalmente reduzido e totalmente desnaturado, e o modelo é válido na medida em que uma medição reproduz essas condições. Desnaturar expõe cadeias laterais aromáticas que de outro modo estariam no interior de uma estrutura dobrada, e reduzir quebra as ligações dissulfeto para que cada termo de cistina seja contado uma vez. Uma amostra medida ainda dobrada absorve menos do que o modelo prevê, portanto a concentração lida a partir dela sai baixa. Esse é um viés sistemático com direção conhecida e não dispersão aleatória, e conhecer a direção de antemão é o que o torna corrigível: desnaturar a amostra, ou ler o resultado como um limite inferior e não como a concentração.

A segunda suposição é que as cadeias laterais aromáticas são as únicas espécies absorventes na cuvette. Tudo o resto que absorve a 280 nanómetros é cobrado ao peptídeo, portanto um tampão com absorvância real, um vestígio de detergente, ou uma suspensão de partículas finas empurram todos a leitura para cima e a concentração derivada junto com ela. O remédio é um branco feito com o mesmo solvente sem o peptídeo. Condições ácidas são usadas em muito do trabalho com peptídeos exatamente por esta razão, porque um pH baixo suprime a absorvância de muitos componentes do tampão em vez de a acrescentar, e o trabalho sobre Beer Lambert expõe o resto do que a medição precisa.

A terceira suposição é que os cromóforos se comportam de forma independente uns dos outros. O modelo dá a cada anel aromático um coeficiente fixo e não faz qualquer correção para dois deles estarem lado a lado, para um anel enterrado num interior hidrofóbico, ou para uma amostra que se tenha agregado na cuvette. Essas correções são pequenas nos casos para os quais o método foi construído. Não são pequenas de todo para um peptídeo que esteja a agregar, e a agregação é o modo de falha mais difícil de notar por fora porque o espectro continua a parecer uma banda de absorção limpa com uma forma plausível.

Um peptídeo sem triptofano e sem tirosina reduz o total ao termo das ligações dissulfeto. Um peptídeo reduzido sem cistina tem portanto um coeficiente de exatamente zero, e a lei passa então a dizer que qualquer concentração produz uma absorbância de zero. Não é a aritmética a falhar. É a afirmação correta de que a medição não transporta informação sobre quanto peptídeo está na cuvette. Uma única tirosina chega para mudar isso completamente, e um único par de cistinas unidas também, e é por isso que os peptídeos são muitas vezes modificados para transportarem um.

Resolver a lei para a concentração divide a absorbância medida pelo produto do coeficiente e do comprimento de trajeto, portanto um coeficiente que se aproxime de zero produz um número muito grande e de aparência muito confiante, montado inteiramente a partir de ruído. Nada no resultado parece errado na página. A calculadora de concentração de Beer Lambert recusa a sério um coeficiente zero ou negativo por essa razão, e a recusa é a resposta útil e não um inconveniente. Um coeficiente pequeno mas diferente de zero é quase tão mau, porque amplifica o mesmo erro em vez de o eliminar, e a amplificação é inteiramente silenciosa.

Para um peptídeo desses a concentração não é conhecível a partir da sequência. Nenhuma aritmética sobre as letras a vai produzir, e qualquer figura específica para um peptídeo específico teria de vir de uma medição ou de uma fonte citada que descrevesse essa molécula exata, e nenhuma das duas coisas este site pode fornecer. O que se pode dizer é a forma do problema: as opções são um método de detecção que responda a outra coisa, ou uma medição feita num comprimento de onda em que parte da amostra absorve. Dizê-lo de forma simples é mais útil do que uma figura plausível, porque um coeficiente errado propaga-se diretamente para uma concentração e daí para todas as diluições calculadas a partir dessa concentração.

O coeficiente molar não é a única forma que este número toma. Divida-o pela massa molar média e obtém um coeficiente de extinção mássico, escrito convencionalmente em mL g^-1 cm^-1, que é a forma que faz par com uma concentração em gramas por litro em vez de moles por litro. A aritmética é simples: um coeficiente de 12615 para um peptídeo de massa molar média de cerca de 611 dá um coeficiente mássico de cerca de 20.7. A calculadora de peso molecular médio fornece o segundo desses dois números, e converter no sentido inverso é a mesma divisão ao contrário, portanto as duas formas nunca podem discordar desde que a mesma massa molar seja usada nas duas.

Misturar as duas formas é o erro permanente neste assunto, e está errado pela massa molar e não por um fator pequeno, e é por isso que pode passar despercebido tanto tempo. O guia sobre concentração em massa face à molaridade expõe a relação entre as duas unidades de concentração que está por baixo da conversão, e introduzir uma concentração mássica na calculadora de absorbância de Beer Lambert mostra-lhe diretamente a dimensão do erro resultante em vez de a deixar para raciocinar. A saída continua a ser uma absorbância, continua sem unidade, e está simplesmente errada por um fator de várias centenas.