Calculadora de concentracao de Beer-Lambert

Resolver para a concentração põe o coeficiente de extinção no denominador, portanto um erro nele passa um para um e no sentido oposto. Um coeficiente dez por cento alto demais dá uma concentração cerca de nove por cento baixa demais, porque dividir por 1.1 em vez de por 1.0 devolve 0.909 do valor pretendido. Nada na aritmética o avisa. A saída é um número limpo com várias casas decimais, e a dimensão do erro é pequena o suficiente para passar por uma diferença de arredondamento se não a estiver a procurar.

Como o coeficiente aditivo ignora a maior parte de uma sequência, dois peptídeos bastante diferentes podem partilhar um coeficiente e portanto partilhar um erro sistemático. Isso corta nos dois sentidos. Significa que um peptídeo cujo coeficiente calculado por acaso está perto da verdade dá uma concentração de confiança, mesmo quase nada tendo sido modelado, e significa que um peptídeo com aromáticos enterrados ou uma ligação dissulfeto por contar dá uma concentração que está consistentemente desviada num sentido em que se pode raciocinar de antemão em vez de espalhada de forma imprevisível. Uma diferença de um resíduo na contagem de aromáticos tem um efeito maior nesta página do que tudo o resto do cálculo, o que torna a contagem digna de ser verificada antes de o número ser usado para seja o que for.

A disposição também não consegue detetar que está a medir-se a espécie errada. A lei descreve a transmissão através de uma solução homogénea, portanto uma leitura de uma amostra que tenha agregado, ou uma que contenha outra coisa que absorve no mesmo comprimento de onda, é convertida num número rotulado como a concentração do peptídeo. A aritmética está certa e o rótulo está errado, e é por isso que uma previsão da calculadora de absorbância de Beer Lambert é uma verificação cruzada genuinamente útil e não uma reformulação. Nada na reorganização consegue distinguir uma concentração de peptídeo de uma concentração de suspensão, porque ambas produzem uma leitura e ambas têm um coeficiente associado algures.

O erro que mais importa na prática está na própria absorbância, porque a absorbância é uma grandeza logarítmica lida num instrumento com uma precisão absoluta mais ou menos fixa. O erro relativo na concentração é igual ao erro relativo na absorbância, portanto uma leitura de 0.055 com uma precisão absoluta de 0.005 traz cerca de nove por cento de incerteza, enquanto uma leitura de 0.005 com a mesma precisão traz cerca de cem por cento. Mesmo instrumento, mesmo coeficiente, mesmo comprimento de trajeto, e uma qualidade de resposta completamente diferente. O coeficiente acrescenta o seu próprio erro relativo por cima, portanto se o coeficiente é incerto em dez por cento e a leitura é incerta em dez por cento e as duas são independentes, a concentração está mais perto de vinte por cento de erro do que de dez.

A razão vale a pena perceber porque muda o que se faz a esse respeito. O instrumento não é nove por cento pior em leituras baixas; é igualmente preciso em termos absolutos de absorbância, e dividir um número pequeno por essa incerteza absoluta produz uma grande incerteza relativa. Portanto repetir a medição com mais cuidado não é o remédio. Aumentar a absorbância é, por uma de três vias: um trajeto mais longo, uma concentração mais alta, ou um comprimento de onda diferente em que a amostra absorve com mais força. As duas primeiras são gratuitas, porque ambas são decisões tomadas antes de a amostra chegar ao instrumento em vez de correções aplicadas a posteriori.

Ler uma absorbância abaixo de cerca de 0.1 num instrumento de bancada raramente compensa, seja o que a aritmética produzir. O hábito útil é prever primeiro a leitura e apontar para um sítio entre 0.2 e 1.0, onde o erro relativo é menor e o detetor ainda tem sinal suficiente para trabalhar. O guia sobre arredondamento e volumes pequenos cobre como uma grandeza medida pequena deve ser escrita depois de a ter. Prever antes de medir é o único ponto de todo o procedimento em que o custo de uma má escolha ainda não foi pago, e demora segundos.

Um instrumento comunica uma diferença entre dois níveis de luz, e o que conta como zero depende inteiramente do que a leitura foi referenciada. Um branco feito com o mesmo solvente e o mesmo tampão mas sem peptídeo mede a absorvância contribuída por tudo o mais na cuvette. Subtraia isso e o resto pertence ao peptídeo. Falhar essa subtração cobra todo o fundo à amostra, e é por isso que uma concentração derivada de uma leitura sem branco num tampão absorvente sai alta por uma margem grande e inteiramente sistemática. O trabalho sobre Beer Lambert mostra como isto é normalmente arranjado.

Essa é a razão de fundo pela qual o trabalho com peptídeos no ultravioleta é tão frequentemente feito em ácido diluído em vez de num tampão convencional. Um pH baixo impede que muitos componentes de tampão comuns absorvam a 280 nanómetros desde o início, portanto o branco é pequeno e fácil de acertar em vez de grande e subtraído com esperança. Também reduz a hipótese de o próprio peptídeo mudar de estado no tampão, o que invalidaria o coeficiente tanto como o branco. Nenhuma das escolhas é gratuita, e ambas são feitas pela sake da qualidade da medição e não pela sake da amostra.

Vale a pena correr duas verificações antes de uma concentração derivada ser usada em qualquer lado. Primeiro, confirme que a absorbância está num intervalo em que a leitura significa alguma coisa, o que na prática significa acima de cerca de 0.1 e abaixo de cerca de 1.0. Segundo, converta o resultado numa concentração mássica usando a massa molar do peptídeo da calculadora de peso molecular médio e veja se parece um número que reconhece. Uma grande distância entre os dois é quase sempre um erro de unidade e não um problema de química, e a relação entre as duas unidades de concentração está exposta no guia sobre concentração em massa face à molaridade . Se o coeficiente vier da calculadora de coeficiente de extinção , compare-o com o número de resíduos aromáticos enquanto está a tratá-lo.

Uma terceira verificação é diluir. Ler uma amostra e depois uma diluição conhecida dela deve dar duas concentrações na razão do fator de diluição, e a calculadora de diluição seriada expõe como montar isso de forma limpa. Quando os dois resultados não estão nessa razão, a relação não é linear no alcance que acabou de cobrir, o que aponta diretamente para agregação ou luz espúria e não para aritmética. E se o coeficiente envolvido era desde o início muito pequeno, nenhuma destas verificações salva o resultado, porque dividir uma medição por algo próximo de zero não é uma medição.